測定原理

 

測定原理

本法:umu試験(マイクロプレート法)はumuウムC’-’lacラックZ融合遺伝子を導入した、ネズミチフス菌NM2009株を用います。

  (1) まず、変異原によって菌のDNAへの損傷が生じ、SOS遺伝子が誘発されます。
  (2) 一連のSOS遺伝子群のうち、突然変異に直接関与しているumuC遺伝子の発現を、umuC’-’lacZ融合遺伝子の発現として作用が行われ、その産物であるumuC’-’lacZ雑種タンパクが産生されます。
  (3) このタンパクはβ-galactosidase酵素活性を有しますので、酵素発色基質X-Galを用いて青色の発色の強弱を指標として変異原性を測定いたします。

このことより、umu試験はDNA修復を指標とする試験であり、
        「細菌を用いるDNA修復試験」(DNA損傷検出試験) です。
Ames試験は 「細菌を用いる復帰突然変異試験」です。

 

******** umu試験とは ********
DNAを損傷させ変異をおこさせる変異原性物質などを検索する試験において、umu試験は人間(動物)の代わりに微生物(サルモネラ菌)を用い、そのDNAを修復する能力(SOS反応)を利用した試験法です。
この試験に使用するテスト菌株は、サルモネラ菌の遺伝子組み換え体を使用しております。

紫外線(UV)、化学物質などによりサルモネラ菌のDNAへの損傷が生じた際、それを修復し生命維持するため、SOS反応(umu遺伝子)が起こることを利用し、更に融合された遺伝子(lac遺伝子)より、産生された酵素量を測定する酵素反応を利用した方法です。

 

  (1) 紫外線、X線、化学物質などにより、テスト菌であるサルモネラ菌のDNAへの損傷が生じる。
  (2) SOS反応が生じて、これに関与しているSOS遺伝子群(約20種類ある)のひとつであるumu遺伝子)が働きだします。
  (3) あらかじめこのumu遺伝子に、融合されたlac遺伝子(β-ガラクトシダーゼ発現遺伝子)がSOS遺伝子群と同時に発現し、酵素のβ-ガラクトシダーゼが産生されます。
(umuC‘-‘lacZ)

紫外線(UV)、X線、化学物質など

       変異原性物質        DNA損傷       SOS遺伝子発現umuC-‘lacZ
   紫外線(UV)、X線、化学物質など
組み換えサルモネラ菌
 (NM2009菌株)

 

  (4) 酵素反応
この酵素;β-ガラクトシダーゼ活性を基質:X-Galを加えて、青色に発色する色の強さを測ることにより、DNA損傷の程度を知ることができる。

酵素反応
        X-gal(無色透明)             糖成分          インドール(青色)
5-brome-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
   galactpyranose    5-Brome-4-chloro-3-indole
   
             X-galのβガラクトシダーゼによる加水分解

 

(既知のDNAに損傷を与える変異原性物質を試料としたときの試験結果 例 )

       物質濃度
        低 ←                        → 高

       変異原性物質を試料としたときの試験結果 例

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